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支原體快速檢測試劑盒(細胞培養)

更新時間:2017-12-14      點擊次數:3546

《Quick Cell快速支原體檢測試劑盒》主要用于檢測細胞培養上清或別的液體樣品(如血清)中是否含有支原體污染,該試劑盒僅用于基礎科研。

哺乳動物細胞的培養,支原體(Mycoplasma)污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數,導致實驗結果的不準確、甚至*錯誤。從2013年開始,《Nature》期刊已正式要求投稿的文章,如涉及細胞培養都要進行支原體檢測。本試劑盒可以檢測:(1)M.Hyorhinis、(2)M.Fermentans、(3)M.Arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)Acholeplasma Laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M.bovis、(11)M. buccale、(12)M. arthritidis、(13)M. pulmonis等幾乎所有常見的污染細胞的支原體(注:M.為Mycoplasma的縮寫)。以上13種支原體約占細胞支原體污染的99%以上,本試劑盒產品全部可以檢測。絕大多數支原體污染集中于前8種。注意:本試劑盒無法檢測Ureaplasma Urealyticum支原體!Ureaplasma Urealyticum在支原體污染種極其罕見。

與PCR法檢測支原體比較,本試劑盒產品優勢優勢顯著:

比較內容

支原體檢測PCR法

Quick Cell 快速支原體檢測試劑盒

操作時間

3小時

1小時

是否需要樣品處理

樣品需預處理,DNA提取

無需樣品處理,直接使用上清

靈敏度

靈敏度低

較PCR法提高1000倍

是否需要電泳

需要電泳及染色

不需電泳,目測結果

試劑盒組成

(1)溶液Ⅰ:1150 μL (50次檢測)

(2)溶液Ⅱ:50 μL(50次檢測)

(3)溶液Ⅲ:指示劑,50 μL(50次檢測)

(4)陽性支原體DNA:50 μL

(5)礦物油:1500 μL

使用方法

1. 待測樣品的準備:為了準確判斷細胞是否有支原體的污染,待測的細胞培養液樣品來源于至少培養三天且匯合度在70-90%左右的細胞培養上清(貼壁細胞),無需離心。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后,至少讓細胞生長3天再取培養液進行檢測,也無需離心。哺乳動物細胞的存在不會影響檢測結果。

注:收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測,請放于-20℃或-80℃冰箱保存,不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個月,在-80℃可以長期保存。此外,為了節約檢測成本,可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存,而后一起檢測。

2. 反應體系的配制

表1:恒溫反應體系的配制

     組   份

理論單個樣品用量

樣品總數

總體積

      溶液Ⅰ

23 μL

N

23×N×1.08 μL

      溶液Ⅱ

1 μL

N

1×N×1.08 μL

      溶液Ⅲ

0.18 μL

N

0.18×N×1.08 μL

(1)將溶液Ⅰ、溶液Ⅲ從-20℃冰箱中取出,待其融化后(可在37 ℃ 水浴內放置5-10分鐘以幫助融化),從-20℃冰箱中取出溶液Ⅱ置于冰上。吹吸均勻后,按表1比例,混合溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ。如有多個樣品,為了防止移液誤差,建議溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ用量乘以系數1.08,保證每個反應管中的反應液足量。從配液開始的所有步驟,均在冰上操作。

舉例:如果待測樣品為3個(加上1個陰性和1個陽性對照),則樣品總數為5個。溶液Ⅰ的總體積為23×5×1.08=124.2μL,溶液Ⅱ的總體積為1×5×1.08=5.4μL,溶液Ⅲ的總體積為0.18×5×1.08=0.972 μL將溶液、Ⅱ、Ⅲ混合均勻。

注:溶液Ⅱ必須一直在-20 ℃冰箱中保存,并在操作時置于冰上。溶液Ⅱ即使在-20 ℃條件下仍為液態,不需置于室溫。

(2)將上述配制好的反應體系,吹打均勻后,按每管24 μL分裝到0.2 mL的PCR管中。盡量保證每管的反應液體積一樣。 PCR管應該使用透明度良好的薄壁PCR管。

(3)往測試管(Test)中加入1μL待測細胞培養液;往陽性對照管(Positive)中加入1 μL陽性支原體DNA;往陰性對照管(Negative)中加入1μL滅菌水;反應液的總體積為25 μL。

注1:裝有陽性支原體DNA的螺口管開蓋之前,用力甩一下,或者用迷你離心機即可。

注2:進行反應體系配制的房間,與進行樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間分開。

3. 反應

PCR儀設置程序:61℃,60 min;10℃, forever;熱蓋溫度,100 ℃。

注意:若實驗室反應場所沒有PCR儀,可用水浴鍋代替,水浴鍋顯示溫度與實際溫度的溫差不超過0.5℃,另須往每個反應管內加入25μL礦物油,以防止水份揮發,然后蓋上蓋子,將反應管插入帶孔的漂板內,放入已經升溫到61℃的水浴內,準確反應60分鐘。

4. 結果判斷

61℃反應60分鐘后,立刻取出反應管,放于室溫。以一張白紙或白色泡沫盒為背景,通過反應管溶液顏色的變化,即可判斷檢測結果。如果溶液為藍綠色,則說明有支原體污染;如果為紫紅色,則說明沒有支原體污染(如圖1)。

注:在61℃反應的時間必須準確計時,zui多不得超過5分鐘,以免出現假陽性。必須在反應后2小時內進行結果判斷,避免室溫下擴增反應進行,影響結果判別。

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